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肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥

因中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)控制骨骼肌運動的神經(jīng)元退化導(dǎo)致的肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis： ALS，也稱漸凍人癥)是一種漸進且致命的神經(jīng)退行性疾病。由于運動神經(jīng)元退化和死亡，肌肉逐漸萎縮致大腦完全喪失控制隨意運動的能力，最終會造成發(fā)音、吞咽，以及呼吸和運動障礙。著名物理學(xué)家霍金就是一名ALS患者。目前還沒有真正可有效治療ALS的藥物和方法。>>>商務(wù)洽談，點此處，在線咨詢

絕大多數(shù)(90-95%)的ALS發(fā)病原因不明，但也有約5-10%的ALS患者表現(xiàn)出了家族遺傳性，其中超氧化物歧化酶 1(Superoxide Dismutase 1：SOD1)基因突變約占這些遺傳性ALS病例的10%。SOD1也是第一個被鑒定出來的ALS風(fēng)險基因[1]，因此很快就有科學(xué)家構(gòu)建了一種含有第93位甘氨酸突變?yōu)楸彼?G93A)的人SOD1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，全名為B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J轉(zhuǎn)基因小鼠[2]。該轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中被轉(zhuǎn)入了23個拷貝的人源SOD1*G93A突變基因，接下來我們將其簡稱SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠。

圖二：SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠是以B6和SJL雜交子代為背景品系，通過原核注射和胚胎移植得到的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，因此其毛色多樣，圖片來自Jax實驗室(https://www.jax.org/strain/002726)

自1996年SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠問世以后，其就被廣泛應(yīng)用于ALS藥物研發(fā)的臨床前動物試驗中。到2004年，短短8年時間內(nèi)，已至少有50篇文章描述了從小分子到病毒載體的各類ALS治療方案，可延長SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的壽命，其中最長可以延長壽命100天(78%的壽命延長)。這些藥物很快進入臨床試驗，然而，迄今為止，除了利魯唑(最多延長ALS患者兩個月壽命)之外，沒有任何一種藥物顯示出對人類ALS疾病的進程有顯著影響[3]。這給醫(yī)藥公司帶來了巨大損失，如2008年在美國國家科學(xué)院院刊上發(fā)表的一篇文章顯示鋰可以將SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的存活時間延長30天[4]。由于鋰早已經(jīng)被用于治療精神分裂癥，許多ALS患者開始超說明書服用該藥物，希望減緩疾病進程。然而，招募了數(shù)百名患者，花費了遠超1億美元的三個同時啟動的獨立III期臨床試驗結(jié)果卻顯示鋰對ALS無任何治療效果。

其實不僅僅是ALS的藥物研發(fā)，在整個醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域，動物實驗結(jié)果的平均臨床轉(zhuǎn)化率也是非常低的，平均在11%左右 。那么到底是什么原因?qū)е铝巳绱烁弑壤膭游飳嶒灲Y(jié)果無法實現(xiàn)在人類的臨床轉(zhuǎn)化呢?

1999年，美國麻省理工學(xué)院的機械工程師詹姆斯·海伍德在得知他的哥哥史蒂芬·海伍德被確診患有ALS，并無任何有效治療方法后，與家人一起創(chuàng)立了一家非盈利性生物技術(shù)公司，即ALS 治療開發(fā)研究所 (ALS-TDI)。ALS-TDI成立后開展了一項旨在尋找SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠實驗結(jié)果臨床轉(zhuǎn)化失敗原因的項目，即使用SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠重復(fù)已發(fā)表科研論文中的動物實驗，以找出其臨床轉(zhuǎn)化失敗的原因。

在ALS-TDI開展的重復(fù)性實驗中，他們不僅嚴(yán)格執(zhí)行盲法對照，而且對給藥組和對照組的動物進行了更為精細的分配和動物篩查以排除系統(tǒng)誤差。他們分組及實驗要求包括：

⑴ 年齡匹配;

⑵ 性別匹配;

⑶ 同窩匹配：即使用同一天出生的同一非轉(zhuǎn)基因母親和轉(zhuǎn)基因父親的后代進行分組，具體來說，治療組中的每個雄性(和雌性)在對照組中都有一個同窩兄弟(和姐妹);

⑷ 樣本量設(shè)定：每組使用動物數(shù)量為24只(12雌，12雄);

⑸ 死因篩查：檢查記錄每一只動物的死亡原因，排出非ALS致死個體;

⑹ 轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)監(jiān)控：有研究證明SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠在傳代過程中會出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)丟失的現(xiàn)象，且低拷貝的轉(zhuǎn)基因小鼠的平均壽命會加長。

在這一嚴(yán)格實驗分組和動物篩查條件下，ALS-TDI的科研人員總共使用了5429只SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠測試了包括利魯唑在內(nèi)的100多種(大部分已有論文發(fā)表并證明可延長SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠壽命)候選化合物，卻沒有發(fā)現(xiàn)任一化合物表現(xiàn)出可延長SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠壽命的效果(圖三)。

圖三：ALS-TDI以SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠開展的重復(fù)實驗結(jié)果與已發(fā)表實驗結(jié)果對比[3]

為找出導(dǎo)致那些已經(jīng)發(fā)表實驗結(jié)果無法被重復(fù)的原因，他們以在ALS-TDI開展實驗中所使用的2000多只對照小鼠作為研究對象，進行了計算機分組模擬實驗。由于這些小鼠從出生到死亡及死亡原因的信息在ALS-TDI都有詳細的記錄，因此他們能夠以所有對照小鼠為數(shù)據(jù)庫，分析前述重復(fù)實驗中設(shè)定的不同分組和動物篩查條件對實驗結(jié)果的影響。即通過計算機對這些沒有經(jīng)過任何藥物處理的小鼠進行分組，將一組設(shè)為假定的實驗組，而另一組設(shè)為假定的對照組，然后依據(jù)已有的小鼠死亡時間記錄，統(tǒng)計兩組小鼠之間是否存在顯著差異。經(jīng)過多次重復(fù)，計算出現(xiàn)5%以上顯著差異的百分比。由于這些對照小鼠沒有接受過任何化合物處理，因此如果假定的實驗組和對照組中出現(xiàn)了顯著性差異，那么其來源應(yīng)該是分組時的系統(tǒng)誤差。

結(jié)果顯示，在樣本量大小為4的計算機分組模擬對比實驗中，在隨機分組和不進行死因篩查及排除低轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)個體條件下，兩組間出現(xiàn)顯著差異的可能性超過了50%。而隨機分組的同時進行死因篩查并排除低轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)個體和進行性別匹配的分組條件下，樣本量為4的模擬分組實驗中也有30%的可能出現(xiàn)兩組死亡時間的顯著差異(圖四)。隨著樣本量的增加，出現(xiàn)顯著性差異的可能性逐漸減少，但要實現(xiàn)低于5%(統(tǒng)計學(xué)上通常設(shè)置的顯著置信區(qū)間)的顯著性差異，樣本量要達到每組24只動物。如果不做分組條件控制，即使樣本量到50只也難以排除系統(tǒng)誤差。

圖四：分組條件導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差[3]

ALS- TDI的這個計算機模擬實驗結(jié)果說明，前述那些已經(jīng)發(fā)表的基于SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠實驗結(jié)果無法實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的真正原因極大可能源于其實驗設(shè)計的不合理。這些實驗因為沒有排除分組時的系統(tǒng)誤差而導(dǎo)致了假陽性結(jié)果。這個研究也暴露了當(dāng)下使用實驗動物開展研究的諸多問題，如盲目地追求減少使用動物的數(shù)量;對所用動物遺傳、微生物和繁殖等特性不了解;實驗過程中對動物關(guān)注不夠，不清楚動物發(fā)病或死亡的真正原因等。這些問題不僅僅需要引起實驗動物從業(yè)人員的注意，科研人員同樣需要給予關(guān)注。因為實驗設(shè)計不嚴(yán)謹(jǐn)導(dǎo)致的假陽性結(jié)果不僅是人力、物力和財力的巨大浪費，也嚴(yán)重有違動物實驗倫理福利，這樣的實驗不會帶來科學(xué)進步，且浪費了大量實驗動物的生命。比如在ALS-TDI開展的無法重復(fù)出已發(fā)表結(jié)果的實驗中，那些已經(jīng)發(fā)表的工作累計使用小鼠的數(shù)量就超過了18000只。此外，在動物實驗倫理申請時常用替代、優(yōu)化和減少(俗稱3R原則)原則來指導(dǎo)倫理審查工作，有時為了滿足3R原則中的“減少”原則，加上開展實驗成本的考慮，往往選擇使用最少的動物數(shù)量(比如多為每組6只)，但從ALS-TDI的這個研究看，樣本量過小，會導(dǎo)致系統(tǒng)誤差加大，因此極大可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。這個時候大家或許忘了3R原則使用的大前提是要能夠?qū)崿F(xiàn)擬開展實驗的科學(xué)目標(biāo)，如果單純?yōu)榱恕皽p少”而使用更少的實驗動物導(dǎo)致科學(xué)目標(biāo)無法實現(xiàn)，那不是減少，而是對動物生命的漠視。

來源：實驗動物那些事兒

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